L'opus permet d'incarner à nouveau le héros du second volet, Ezio, suite à son statut de maître assassin fraîchement acquis. Il évoluera principalement à Rome et s'acharnera, avec l'aide de plusieurs autres assassins, de dissoudre l'ordre des templiers. Au niveau du multijoueur, les joueurs pourront aider les templiers ou la guilde des assassins via différents personnages aux armes et techniques d'assassinat bien distinctes.
Assassin's Creed : Brotherhood est attendu pour fin 2010 sur PC, PS3 et Xbox 360